Các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

1. Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi khuẩn là gì?

Phân lập là khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn.

Mục đích của phương pháp phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc sẽ mang tính đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc chẩn đoán vi khuẩn học. Các nhà nghiên cứu vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.

Điều quan trọng cách nuôi vi khuẩn là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Do vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết đều phải được khử trùng trước khi sử dụng.

2.1 Dạng mẫu nuôi cấy

• Dạng dịch mẫu chỉ định nuôi cấy vi khuẩn đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích.
• Dạng trên bề mặt của môi trường rắn chứa thạch (từ 1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.
• Dạng mẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%).

2.2 Dụng cụ cấy

• Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.
• Que cấy móc: Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.
• Que cấy vòng: Là que cấy kim loại đầu có vòng tròn, dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏng.
• Que cấy trang: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.
• Ống hút thủy tinh: Dùng để chuyển một lượng vi khuẩn cần thiết lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng.
• Đầu tăm bông vô trùng: Dùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn.

3.1. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri

• Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân lập.
• Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo.
• Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm.

3.2. Kỹ thuật cấy trang

• Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri.
• Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Sau đó, để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
• Mở đĩa petri, nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch. Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.
• Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.

3.3. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

• Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa rồi hơ nhẹ phần cán, rồi cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.
• Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Dùng ngón út của tay phải để mở nút bông. Sau khi mở nút bông, xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.
• Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và làm nguội que cấy (áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội). Nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống để thu sinh khối. Hơ nóng miệng ống nghiệm và đậy nút bông rồi đặt ống nghiệm vào giá đỡ.
• Đầu que nuôi cấy vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới rồi mở nút bông và khử trùng miệng ống nghiệm. Tiếp đó, đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.
• Nhúng và khuấy nhẹ nhàng que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.
• Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm và đậy nút bông.
• Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.

3.4. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng

Phương pháp này tiến hành tương tự như trên, nhưng có một số khác biệt sau:

• Cấy giống lên trên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống.
• Sau đó, cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên mặt thạch nghiêng.

3.5. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rời

Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì nó cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri để tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản trong cách nuôi vi khuẩn với pipet đầu rời như sau:

• Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định đó là: 0,1 ml, 1- 20ml, 20- 20ml, 0,2- 1 ml, 1-5 ml, 1- 10 ml. Nên chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác.
• Pipet đầu rời có hai nấc: Nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch; nấc 2 (vượt quá nấc 1) dùng để bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.
• Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống thì cần phải tiến hành trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy.
• Tay phải cầm pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Sau đó, cắm đầu pipet vào đầu tip.
• Dùng tay trái giữ ống nghiệm và bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út, áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, sau đó hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.
• Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống rồi hút lấy dung tích cần thiết. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út tay phải.
• Đầu tip có chứa vi sinh vật cần được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.
• Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.
• Đưa đầu tip vào bên trong môi trường rồi bơm dịch giống vào môi trường. Sau đó, rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình và đậy nút bông.
• Đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer cần phải khử trùng tuyệt đối đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa.

Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi nuôi cấy vi khuẩn xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn như: Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ; độ ẩm trong quá trình nuôi ủ cần đảm bảo đủ lượng nước; khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.