Xác định loại vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

Nhuộm gram là phương pháp dựa trên đặc tính lý hóa của thành tế bào mà phân loại vi khuẩn thành 2 loại là vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương. Nhuộm gram có thể được thực hiện trên cả dịch cơ thể hoặc trên mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.

Nhuộm gram là phương pháp xác định loại vi khuẩn nhanh hơn nuôi cấy có ý nghĩa giúp phân biệt sớm các bệnh do nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị cũng như tiên lượng bệnh. Các thuốc thử cần sử dụng cho phương pháp này gồm có:

• Dung dịch tím Gentian
• Dung dịch Lugol
• Cồn tẩy 950
• Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10

Quy trình nhuộm gram sẽ gồm các bước sau:

• Dàn đều bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên lam kính sạch;
• Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;
• Các bước nhuộm:
  • • Đầu tiên phủ dung dịch tím Gentian và để khoảng 30 giây sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen
    • Tiếp theo phủ dung dịch Lugol để cố định màu, cũng để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loại của nó
    • Tẩy màu bằng cồn 950 để khoảng 30 giây và rửa nước. Đây là bước rất quan trọng để phân biệt loại vi khuẩn đã được dung dịch Lugol gắn chắc màu tím vào và loại màu tím bị tẩy trôi
    • Cuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 của Gram để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước sẽ làm các vi khuẩn đã được tẩy hết màu tím bắt lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen sẽ không bị ảnh hưởng.
• Để khô tự nhiên
• Soi dưới vật kính dầu

Vi khuẩn có đặc điểm là lớp peptidoglycan dày ở thành tế bào giúp giữ các phức hợp tím tinh thể nên sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím sẫm Gentian và không bị tẩy màu sau dùng cồn tẩy 950. Những vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram dương như: tụ cầu, phế cầu, liên cầu,...

Vi khuẩn có lớp peptidoglycan mỏng hơn và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iod và sẽ bị khử màu. Sau đó khi dùng dung dịch Fuchsin 1/10 phủ lên thì những vi khuẩn này sẽ bắt màu đỏ hoặc hồng. Các vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram âm.

Như vậy có thể thấy bước tẩy màu rất quan trọng và cần phải có kỹ năng nhất định vì khả năng bắt màu của Gram dương không phải là tuyệt đối.

Vi khuẩn gram dương giả do các yếu tố sau:

• Tiêu bản được cố định khi chưa khô hoặc quá dày
• Màu của cặn thuốc nhuộm gây sai lệch kết quả
• Lugol chưa được đổ hết để cố định màu
• Cổn tẩy chưa đủ thời gian để phân biệt chính xác
• Dung dịch Fuchsin quá đậm hoặc nhuộm quá lâu

Vi khuẩn gram âm giả do các nguyên nhân như không thay Lugol hoặc tẩy cồn quá lâu và không tráng kỹ.